Immunenzimatikus vérvizsgálat a mutatók értelmezésével. ELISA diagnosztika: mi a lényege, az antitestek meghatározása, hogyan történik és milyen betegségek esetén hatásos? Mi az IF diagnosztika

Az ilyen biológiailag aktív anyagok, például immunológiai komplexek tartalmának meghatározásához speciális laboratóriumi vizsgálatra van szükség. Ha hematológiai, fertőző vagy autoimmun betegség gyanúja merül fel, a szakemberek ELISA vérvizsgálatot írnak elő. A cikk során megfontoljuk, hogy mi ez, hogyan készüljünk fel rá, mit mutat, és hogyan lehet megfejteni saját kezűleg.

Milyen vizsgálat ez - ELISA vérvizsgálat? A rövidítés az enzim immunoassay rövidítése, amelynek során meghatározzák a különböző biológiailag aktív anyagok, valamint a biológiai anyagokban lévő antitestek és antigének mennyiségi és minőségi tartalmát.

Mit használnak az enzim immunoassayben:

• gerincvelői folyadék;
• húgycső nyálka, nyaki csatorna;
• magzatvíz;
• az üvegtest tartalma.

Az enzimes immunoassayt szexuális úton terjedő betegségek, fertőző és onkológiai folyamatok diagnosztizálására írják elő, allergiás reakciók, endokrin és reproduktív rendszer működési zavarai, autoimmun és immunhiányos betegségek, valamint egyes vesék kialakulásának kockázatának felmérésére.

A terhesség alatti ELISA vérvizsgálatát a korai felismerés, a fejlődési rendellenességek kezdeti szakaszában és azok dinamikájának ellenőrzése céljából írják elő. Ezenkívül az ELISA elemzés lehetővé teszi azon antitestek szintjének szabályozását, amelyek súlyos neurológiai rendellenességek kialakulását idézhetik elő a gyermekben, ezáltal megakadályozva a szövődmények kialakulását nemcsak a terhesség, hanem a szülés során is.

Lehetővé teszi a felismert problémák előzetes reagálását, és jelentősen javítja mind az anya, mind a baba egészségét.

A vér ELISA előnyei a következők:

• magas (akár 90%) érzékenység;
• a korai diagnózis lehetősége, a betegség stádiumának egyidejű meghatározásával;
• a reagensek alacsony költsége, és ennek következtében a rendelkezésre állás;
• a kutatáshoz szükséges anyag minimális mennyisége;
• minimális átvételi feltételek;
• a reagensek hosszú távú tárolásának lehetősége;
• a kóros folyamat fejlődésének dinamikájának szabályozásának képessége.

Tesztrendszerek

Az enzim immunoassay hátrányai:

• lehetetlen meghatározni a betegség kórokozóját, a laboratóriumban csak immunválaszt kapnak rá
• hamis eredmény megszerzésének lehetősége (nagyon ritka esetekben, főleg a terhesség alatt).

Kiképzés

Az ilyen típusú vérvizsgálat elve specifikus antitestek képződésén alapul az emberi szervezetben, amikor az antigének belépnek, azaz idegen anyagok, fejlődést okozva egyik vagy másik betegség. Kölcsönhatásuk eredményeként „antigén-antitest” komplexek képződnek, amelyeket az enzim immunoassay megvalósítása során kutatásnak vetnek alá.

Ebben a tekintetben, annak érdekében, hogy ne befolyásolják ezeket a komplexeket, és ennek megfelelően a kapott eredmények megbízhatóságát, az ELISA vérvizsgálata és egyéb biológiai anyagok bizonyos előkészítést igényelnek.

Ezenkívül 14 nappal a javasolt vizsgálat előtt felfüggesztik a specifikus kezelést, és az antibakteriális, vírusellenes szerek alkalmazását gyógyszerek megáll.

Az ELISA-hoz vért vénából vesznek. Közvetlenül a vérvétel előtt korlátozza testmozgásés kerülje a dohányzást és az alkoholfogyasztást.

Számos technika és módszer létezik az enzimimmunoassay végrehajtására: direkt és indirekt módszer, kompetitív és blokkoló módszer.

A vér (bármilyen más biológiai anyag) ELISA-vizsgálatának alapja egy olyan algoritmus, amely két – immun- és enzimatikus – reakció végrehajtásából áll.

Az első során a patológiás ágensek a vizsgálathoz vett biológiai anyag sejtjeinek védőelemeihez kötődnek. Antigén-antitest immunkomplex képződik. Ez így néz ki. Az antigének abszolút minden sejt felszínén jelen vannak.

Amikor az idegen sejtek bejutnak a szervezetbe, azokat az immunsejtek (amelyek felületén antitestek találhatók) befogják, amelyek összehasonlítják az újonnan érkezett sejtek felszínéről származó antigénadatokat a saját „memóriájukban” tárolt információkkal. Ezen adatok közötti eltérés esetén a szervezet védekező funkciói, amelyek egy immunkomplex kialakításából állnak, beletartoznak.

Ezt követően enzimatikus reakciót hajtanak végre, amely megjeleníti az előző reakció eredményeit. Elve az anyag egyikből a másikba való átalakulásán alapul. Az anyag immunreakciója során képződő ELISA minden típusához tartozik egy bizonyos enzim, amelynek feldolgozásával (az oldat festődésének intenzitása alapján) meghatározzák az idegen anyag koncentrációját.

Dekódolás

Az ELISA vérvizsgálatának köszönhetően a laboratóriumi asszisztensek meghatározzák az A, G és M értéket. A vér (egyéb biológiai nyersanyagok) ELISA vizsgálatának pozitív eredménye nemcsak a diagnózis felállítását teszi lehetővé, hanem a betegség stádiumát is , valamint lefolyásának jellege (akut vagy krónikus).

Ezek az immunglobulinok kóros folyamat jelenlétében a páciens testében a betegség különböző időszakaiban képződnek:

• Immunglobulinok M, IgM- a betegség kezdete után öt nappal keletkeznek, és 1,5 hónapig a vérben maradnak, majd eltűnnek. Az IgM kimutatása akut primer kóros folyamat jelenlétét jelzi a szervezetben és fokozott terápiás beavatkozás szükségességét.
• Immunglobulinok G, IgG- a fertőzés után négy héttel jelentkeznek, jelenlétük a szervezetben több hónapig kimutatható. Az IgG kimutatása a személy múltbeli betegségének jelenlétét jelzi az anamnézisben. Tartalmuk növekedése is jelezheti az újrafertőződést.
• Immunglobulinok A, IgA- a fertőzés időpontjában jelennek meg, és négy hétig jelen vannak a szervezetben. Tartalmuk csökkenése a gyógyulás kezdetét jelzi. Az elemzések ismételt megjelenése, miután a személy kezelésen átesett és felépült, a betegség krónikus formába való átmenetét jelzi. Az IgA és IgG egyidejű kimutatása az ELISA eredményeiben egy krónikus folyamat jelenlétét is jelzi a szervezetben.

Azt is meg kell jegyezni, hogy az IgG és az IgM egyidejű jelenléte az elemzésekben azt jelzi, hogy a krónikus folyamat súlyosbodott, és a betegnek el kell kezdenie a kezelést. Ha a vizsgálat során egyik immunglobulin sem volt kimutatható, az immunválasz hiányát jelenti.

A laboratóriumi kutatás modern típusát képviselő ELISA vagy enzim immunoassay lehetővé teszi, hogy bizonyos betegségekre specifikus antitesteket vagy antigéneket találjon a vérben. Ez lehetővé teszi a betegség etiológiájának és stádiumának meghatározását. Ugyanakkor az ilyen típusú kutatások eredményei mind mennyiségileg, mind minőségileg kiadhatók. Tehát nézzük meg részletesen az enzim immunoassay módszer elvét, módszertanát és lényegét.

Mi az enzim immunoassay

Az egészségi állapot legteljesebb átfogó felmérésére kijelölt enzim immunoassay lehetővé teszi az általános egészségi állapot felmérését és védő funkcióinak értékelését. Ez a laboratóriumi vizsgálat lehetővé teszi a fertőző, autoimmun, hematológiai patológiák diagnosztizálását vérvizsgálat során.

Az enzim immunoassay lényegét az alábbi videó tárgyalja:

Kinek van hozzárendelve

Ez a vizsgálat az alábbi betegségekben szenvedő betegekhez rendelhető:

• vírusos eredetű betegségek, beleértve a hepatitist;
• szexuális úton terjedő betegségek - chlamydia, trichomonas, szifilisz, ureaplasma, mycoplasma;
• immunhiány;
• preoperatív átfogó vizsgálat.

ELISA vérvizsgálatot is előírnak a hormonszint meghatározására és az elvégzendő terápia minőségének értékelésére.

Az orvos előírhatja ezt az elemzést a meglévő betegség stádiumának beállítására, amely lehetővé teszi az alkalmazott kezelés időben történő módosítását. És a kapott adatok nagy pontossága lehetővé teszi, hogy a legrészletesebb képet kapjon az egészségről. Ugyanakkor a vizsgálat elvégzése után nagyon rövid időn belül adatokat nyernek, ami lehetővé teszi a kóros folyamat fejlődésének dinamikájának nyomon követését.

Miért kell ezeket a teszteket elvégezni?

Mivel az ELISA vérvizsgálatnak köszönhetően jelentős mennyiségű információhoz juthat az egészségi állapotról és a szervezetben előforduló kóros folyamatokról, ez teszi lehetővé a kiindulási adatok (általános egészségi állapot, állapot) legteljesebb figyelembevételét. a betegségről, a kóros folyamat fejlődésének dinamikájáról, az alkalmazott terápia hatékonyságának mutatójáról) a kezelési sémák összeállításakor.

Emiatt a kezelés legkifejezettebb eredményének és a szervezetben a kóros folyamat leggyorsabb befejezésének elérése érdekében ELISA vérvizsgálatot írnak elő. Az immunrendszer súlyos betegségei, a vér antigének jelenléte és az allergiát kiváltó okok a kapott adatok alapján gyorsabban, a leghatékonyabb módszerekkel gyógyíthatók.

Az ELISA-elemzés kijelölése különféle patológiák esetén történik, és csak az orvos utasítása szerint szabad elvégezni. Az elemzés gyakoriságát is az orvos határozza meg, és az ELISA elemzéshez véradáskor a legteljesebb a betegség képe. Mivel a betegség lefolyásának dinamikáját ennek az elemzésnek a többszöri elvégzésével is meg lehet kapni, leggyakrabban három-öt alkalommal véradás írható elő. Ez lehetővé teszi a vérben lévő antitestek mennyiségének összehasonlítását különböző időintervallumokban.

Az ilyen eljárások típusai

Az enzim immunoassay többféle típusa létezik. Különböznek az emberi szervezetből vett folyadék típusában, amely alapján összetételét és bizonyos antigének jelenlétét vizsgálják.

Ugyanakkor nemcsak emberi vért, hanem más folyadékokat is lehet elemzésre venni:

• magzatvíz,
• gerincvelői folyadék,
• az üvegtest tartalma
• kenetek,
• nyálka a húgycsőből és a nyaki csatornából.

Maga a művelet egy bizonyos típusú folyadék felvételére szabványos, és nappali kórházban végzik.

A tartás jelzései

Általában az orvos ELISA-elemzést ír elő, ha részletes képet kell kapni a jelenlegi betegségről, amely bármilyen formában előfordul: krónikus, lassú vagy akut. És a következő feltételek és terápiás célok tekinthetők az ilyen típusú elemzés indikációinak:

• bizonyos betegségek antigénjeinek keresése;
• a hormonális állapot meghatározása;
• a hepatitis vírus kimutatása a szervezetben;
• kutatás az adott témában;
• bármilyen fertőző betegség elleni antitestek keresése;
• vizsgálat a test autoimmun elváltozásainak jelenlétére.

Az enzim immunoassay-hez lásd az alábbi videót:

Ellenjavallatok a tartásra

Az enzim immunoassay ellenjavallatait a mai napig nem azonosították.

Terhesség alatt, amikor a vér hormontartalma folyamatosan változik, ismételten el kell végezni ezt az elemzést az eredmény megerősítéséhez. Az újszülötteknél és a csecsemőknél is tévesek lehetnek a vizsgálati adatok: a magzati fejlődés során bizonyos típusú antitestek az anya méhlepényén keresztül kerülhetnek a magzat vérébe. Ezért jelenlétük az elvégzett elemzésben nem tekinthető egy meglévő fertőzés jelének.

Tesztelje a biztonságot

Bármilyen folyadék emberi szervezetből történő eltávolításának elvégzése nem jár negatív hatással a szervezetre. A teljes sterilitás a manipulációk során elkerüli a fertőzés valószínűségét bármilyen betegséggel.

Felkészülés az eseményre

A vizsgálat legmegbízhatóbb eredményeinek elérése érdekében tartózkodnia kell az alkoholos italok és a kábítószerek fogyasztásától, mielőtt vért (vagy más folyadékot) vesz az elemzéshez.

Hogyan zajlik az eljárás, érzések közben

Az ELISA-teszt elvégzéséhez a beteg vérét szigorúan éhgyomorra veszik: az eljárás előtt legalább egy órával semmilyen formában nem szabad enni. Az elemzést a cubitalis vénából veszik.

Az esetleges betegségek jelenlétét és a szedett gyógyszereket előre jelezni kell az orvosnak, leggyakrabban a véradáskori gyógyszereket töröljük. Az eljárás során az érzések hasonlóak a biokémiai elemzéshez szükséges vérvételhez.

Az eredmények megfejtése

Az ELISA diagnosztika lehetővé teszi a fertőzés jelenlétének a szervezetben, a kóros folyamat aktivitásának és a meglévő fertőzés etiológiájának meghatározását. Az elemzés eredményének gyors (egy napon belüli) kézhezvétele az ilyen típusú vizsgálat egyik előnye.

A kapott információ dekódolásának folyamatát az orvos végzi. Ugyanakkor figyelembe kell venni, hogy a folyamatok dinamikájára kapott eredmények helyessége garantált, ha az elemzéseket egy laboratóriumban végzik.

Az eljárás átlagos költsége

Az ELISA vizsgálat átlagos ára az elemzés irányától és a konkrét értékek meghatározásától függ. Így a szerológiai markerek meghatározása fertőző betegségek különböző típusú (anti-HAV IgG, anti-HAV IgM, HBsAg) ára 200-320 rubel, és 2 munkanapon belül elvégzik. Az eljárás költségének mutatóját is előnyének tekintik: a bármilyen típusú kutatás árának elérhetősége lehetővé teszi a kutatások elvégzését bármilyen költségvetéssel.

Az ELISA-vizsgálat költsége a szabályzattól függ egészségügyi intézmény, azonban nyilvános eljárásnak kell tekinteni, amely lehetővé teszi, hogy részletes képet kapjon a fennálló betegségről és a legteljesebb kezelést nyújtsa.

Az ELISA-vizsgálat normáiról és jellemzőiről lásd az alábbi videót:

A test állapotának (különösen a védőfunkcióinak) átfogó értékeléséhez enzimhez kötött immunszorbens vizsgálatot (ELISA) írnak elő. Az ELISA vérvizsgálatot fertőző, autoimmun, hematológiai patológiák, elsődleges és másodlagos immunhiányok diagnosztizálására végezzük. Ebben a cikkben azt javasoljuk, hogy részletesebben megvizsgáljuk, mi az ELISA vérvizsgálat, valamint milyen jelzések léteznek annak végrehajtására.

Az ELISA-val végzett vérvizsgálat kijelölésének jelzései és működésének elve

Amint azt már megjegyeztük, az ELISA vérvizsgálat egy olyan laboratóriumi vizsgálat, amellyel antigéneket vagy antitesteket határoznak meg a vérmintában. Ez az elemzés a hormonok, immunológiai komplexek és immunglobulinok szintjének kimutatására szolgál. Az ELISA analízis elvégzésére a következő jelzések vonatkoznak:

• Allergia diagnózis.
• Vírusos eredetű betegségek diagnosztizálása - Epstein-Barr vírus, herpesz, hepatitis, citomegalovírus.
• Szexuális úton terjedő fertőzések diagnosztizálása - mycoplasma, ureaplasma, szifilisz, trichomonas, chlamydia.
• Az immunhiány definíciója.
• Onkológiai patológiák diagnosztikája.
• A terápia hatékonyságának értékelése.
• A hormonszint meghatározása.
• Preoperatív átfogó vizsgálat.

Az enzim immunoassay hatásának elve az immunglobulinok (specifikus fehérje antitestek) jelenlétére vonatkozó vérvizsgálaton alapul. Az immunglobulinokat az immunrendszer termeli, amikor az antigének (idegen mikroorganizmusok) belépnek az emberi szervezetbe. Ezek az immunmolekulák különféle fertőző ágensekhez kötődnek és semlegesítik azokat. Az immunglobulinok fontos megkülönböztető jellemzője a specifitásuk. Ezeknek a jellemzőknek köszönhetően egy specifikus antigénhez kötődve antigén-antitest komplexet képezhetnek. Az ELISA vérvizsgálat során ezt a komplexet határozzák meg mennyiségileg és minőségileg.

Ehhez a vizsgálathoz gyakran emberi vért használnak. Elemzési anyagként azonban felveheti az üvegtest, a magzatvíz, a cerebrospinális folyadék tartalmát. A vérmintát általában a páciens cubitalis vénájából veszik. Javasoljuk, hogy éhgyomorra adjon vért (legalább 12 órának el kell telnie az utolsó étkezés óta). Ha a beteg veszi gyógyszerek jelenteni kell az orvosnak, mivel ezek egy része befolyásolhatja az elemzés eredményét. A vizsgálati eredmények megbízhatóságát a kábítószer- és alkoholfogyasztás is befolyásolja.

Az ELISA vérvizsgálatának megfejtése

Ennek az elemzésnek a formája általában negatív (-) vagy pozitív (+) eredményt jelez az egyes immunglobulin-osztályok kiszámításakor.

Javasoljuk, hogy fontolja meg az ELISA vérvizsgálat valószínű dekódolásának értelmezését.

• Az IgG, IgA nem észlelhető, és az IgM eredménye negatív - teljes gyógyulás.
• Az IgM, IgA, IgG eredménye negatív - nincs immunitás a fertőzésekkel szemben.
• Az IgG, IgA pozitív és negatív, valamint az IgM pozitív eredménye - akut fertőzés jelenléte.
• Pozitív IgG eredmény és negatív IgA és IgM eredmény - oltás utáni vagy fertőzés utáni immunitás.
• A pozitív vagy negatív IgG, IgA és negatív IgM eredmény krónikus fertőzés.
• Az IgG, IgM, IgA eredménye pozitív - a krónikus fertőző patológia súlyosbodása.

Az enzim immunoassay során az antitestek osztályának tisztázása mellett azok mennyiségi mutatói is feltüntetésre kerülnek az átiratban. Ezekről azonban csak a kezelőorvos ad részletes magyarázatot.

A tanulmány előnyei és hátrányai

• Viszonylag alacsony költség.
• Egyszerű használat.
• Diagnosztikai lehetőség korai fázis betegség gyanúja.
• A kapott adatok viszonylag nagy pontossága.
• A vizsgálat eredményének megszerzéséhez szükséges rövid idő.
• A fejlődési dinamika nyomon követésének képessége fertőző folyamat szervezetben.
• Magas szintű egységesítés, amely lehetővé teszi a tömeges felmérések elvégzését.
• A kutatás minden szakaszának automatizálása.

Az ELISA vérvizsgálat hátránya, hogy ritka esetekben álpozitív vagy hamis negatív eredményt ad. A vizsgálat során a technikai hibákon túlmenően a páciensnél a hamis eredmények oka lehet reumás faktor, krónikus betegségek jelenléte (amelyben antitestek termelődnek), bizonyos gyógyszerek szedése és anyagcserezavarok.

• Giardiasis.
• Ascariasis.
• Cysticercosis.
• Amőbiázis.
• Trichinosis - a vizsgálatot többször is elvégzik, 4-12 héttel a fertőzés után, meghatározzák az antitestek maximális szintjét.
• Teniasis.
• Opisthorchiasis - végezzen differenciáldiagnózist az akut és krónikus forma betegség.
• Toxoplazmózis.
• Fascioliasis - a betegség akut szakaszában meghatározzák az antitestek jelenlétét.
• Bőr vagy zsigeri leishmaniasis.

Összefoglalva tehát: el kell végezni egy ELISA tesztet a parazitákra az antigének (paraziták hulladéktermékei és azok jelenléte), valamint az antitestek (immunglobulinok) kimutatásához. Specificitás ez a módszer kutatás a paraziták meghatározásában a statisztikák szerint körülbelül 90%. Ennek az elemzésnek köszönhetően az orvos pontosan meghatározhatja a paraziták típusát, teljes számát, és nyomon követheti a fejlődés dinamikáját. kóros folyamatok az antitestek szintjének köszönhetően.

A gyakorlatban leggyakrabban a szilárd fázisú immunoassay három változatát alkalmazzák - indirekt immunoassay, közvetlen immunoassay és szendvics típusú immunoassay. Az ilyen típusú immunológiai vizsgálatok közötti különbségek a következők. Az immunoassay indirekt változatában az antigént az első szakaszban a polisztirol lemez üregeinek felületén szorbeálják. A meg nem kötött antigénmolekulák eltávolítása után az adott antigénre specifikus antitesteket tartalmazó mintát adunk hozzá. Az eredményül kapott antigén-antitest komplexeket jelölőhöz konjugált fajellenes antitestek segítségével mutatjuk ki (1A. ábra). Az immunoassay közvetlen változatában az adszorbeált antigén kimutatása közvetlenül a címkével konjugált specifikus antitestek segítségével történik (1B. ábra). A szendvics típusú immunoassay során az első szakaszban nem az antigén adszorbeálódik a lemez felületén, hanem a vizsgált antigénre specifikus antitestek (szubsztrát antitestek). A meg nem kötött antitestmolekulák eltávolítása után az antigént tartalmazó mintát adjuk hozzá. A képződött szubsztrát-antigén antitest komplex kimutatásához egy másik, térben távoli antigénepitópra specifikus, valamilyen jelöléssel konjugált második antitesteket adunk hozzá (1B. ábra). Az antigén két különböző epitópjára specifikus szendvics típusú antitestek alkalmazása egy immunoassay-ben lehetővé teszi, hogy nagy érzékenységet és specificitást érjünk el az antigén meghatározásában még olyan heterogén mintákban is, mint például a vérplazma.

Rizs. 1. A közvetett (A), közvetlen (B) és szendvics típusú immunoassay (C) elve

Indirekt enzim immunoassay (indirekt ELISA)

Az indirekt immunoassay módszerét egy 3 szakaszból álló folyamat végrehajtása jellemzi, melynek első szakaszában az antigént speciálisan elkészített műanyagon adszorbeálják, a második szakaszban specifikus antitestek lépnek kölcsönhatásba az antigénnel, a harmadik szakaszban pedig antigénnel. -faj antitestek kerülnek a rendszerbe, konjugálva egy enzimmel, amely meghatározza az indikátor enzimreakciót. Ebben a módszerben torma-peroxidázt használnak enzimként. A reakciót speciális 96 lyukú lemezeken hajtjuk végre.

I. Antigén szorpció

Egy 96 lyukú immunoassay lemez üregei lyukanként 0,1-0,5 μg antigént adszorbeálnak 100 μl foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). Az inkubálást 30 percig szobahőmérsékleten végezzük, majd vízszintes lemezrázón rázzuk. A meg nem kötött antigénmolekulák (kétszeres) mosását 0,1% Tween-20-at (PBST) tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal végezzük.

II. blokkolása

A nem specifikus kötőhelyek blokkolása érdekében a tabletta üregeit megtöltjük PBST-vel, és 10-15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

III. A specifikus antitestek rutinja

A szűrés a táblagép vízszintes és függőleges soraiban is elvégezhető. Meg kell jegyezni, hogy az antitestek triturálását akkor kell elvégezni, ha szükséges az antitestek optimális koncentrációjának kiválasztása vagy a titer meghatározása. Abban az esetben, ha az antitestek optimális koncentrációját és/vagy titerét meghatározzák, akkor az ezekhez a specifikus antitestekhez ajánlott hígítást kell alkalmazni.

Dörzsöléskor az antitestek kész hígítását a sor első üregébe vezetik - átlagosan 1-10 μg / lyuk, majd az antitestek szekvenciális hígítását hajtják végre a lyukakban. A specifikus antitestekkel végzett inkubálást 30 percig szobahőmérsékleten végezzük, majd vízszintes tányér rázón rázzuk. A mosást PBST-vel háromszor végezzük.

IV. Enzimjelöléssel konjugált fajellenes antitestek hozzáadása

Detektor (másodlagos) antitestként torma-peroxidázzal konjugált fajellenes poliklonális antitesteket használnak. Leggyakrabban kecske vagy nyúl antitesteket használnak, amelyek a teljes molekulára vagy specifikus antitestek Fc-fragmenseire specifikusak. A kimutatható antitestek koncentrációját a gyártó általában a törzsoldat hígításaként jelzi (például 1:1000). A másodlagos antitestekkel való inkubálást 30 percig szobahőmérsékleten végezzük, majd vízszintes tányér rázón rázzuk. A mosás PBST-vel 5-6 alkalommal történik.

A torma-peroxidáz katalizálja a szubsztrát oxidációjának reakcióját hidrogén-peroxiddal. Az O-fenilén-diamint (OPD) a torma-peroxidáz szubsztrátjaként használják. A reakció eredményeként színes OPD oxidációs termék képződik.

Szubsztrát oldat: 10 ml szubsztrát pufferhez (0,1 M Na-citrát puffer, pH 4,5) adjunk hozzá 0,01 ml 30%-os hidrogén-peroxidot és 0,2 ml 50x OFD oldatot (340 mg OFD 10 ml-ben). etilalkohol; -20°C-on tárolandó).

Az inkubálást 10 percig szobahőmérsékleten végezzük, majd vízszintes rázógépen rázatjuk.

V. Az enzimatikus reakció leállítása

VI. Optikai sűrűségmérés

Közvetlen enzimes immunoassay (direkt ELISA)

A direkt immunoassay módszere csak kisebb eltéréseket mutat az indirekt immunoassay módszeréhez képest. Így az I. és a II. lépés mindkét típusú elemzésben megegyezik. A különbség abban rejlik, hogy a III. stádiumú immunoassay közvetlen változatában enzimjelöléssel konjugált specifikus antitesteket használnak. Szükség esetén lehetőség van enzimjelöléssel konjugált specifikus antitestek eldörzsölésére is, hasonlóan a korábban a nem konjugált antitesteknél leírtakhoz. A IV. szakaszt kihagyjuk, és a további szakaszokat (V-VII) a fentebb az immunoassay közvetett változatánál leírtak szerint hajtjuk végre.

Szendvics típusú immunoassay

Rizs. 2. A "szendvics" típusú immunoassay sematikus ábrázolása. ATp a szubsztrát antitest, ATd a kimutatási antitest, AG az antigén, M a detektáló antitesthez kovalensen kötött jelölés, P a szubsztrát, amelyen a szubsztrát antitest adszorbeálódik.

Az immunassay ezen változatában (2. ábra) a vizsgált antigén térben távoli epitópjaira specifikus antitestpárt használunk.

I. Antitestek szorpciója a szubsztráthoz

Egy 96 lyukú lemez üregeiben az immunológiai vizsgálathoz 1-2 µg szubsztrátot szívjon fel mérőhelyenként 100 µl foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS). Az inkubálást 30 percig szobahőmérsékleten végezzük, majd vízszintes lemezrázón rázzuk. A meg nem kötött antigénmolekulák (kétszeres) mosását 0,1% Tween-20-at (PBST) tartalmazó foszfáttal pufferolt sóoldattal végezzük.

II. blokkolása

A nem specifikus kötőhelyek blokkolására a lyukakat megtöltjük PBST-vel, és 10-15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

III. Inkubálás antigénnel

Az előadszorbeált antitesteket tartalmazó tabletta üregeibe 50 μl vizsgálati oldatot vagy az antigén standard hígításait töltsék. Az antigénhígításokat PBST-ből kell készíteni, mivel a Tween-20 csökkenti a fehérjemolekulák egymáshoz és a lemez felületéhez való nem specifikus kötődését. Mind a tesztoldatot, mind az antigén standard hígításait páronként (vagy 3 ismétlésben) adjuk hozzá, két (három) mérőhelyet használva minden fehérjehígításhoz. Az inkubálást szobahőmérsékleten 30 percig, állandó keverés mellett végezzük. A mosást PBST oldattal háromszor végezzük.

IV. Inkubálás enzimmel jelölt antitestekkel

100 μl enzimjelöléssel konjugált specifikus antitestek oldatát adjuk a tabletta üregeibe. A konjugált antitestek optimális koncentrációját általában a gyártó határozza meg (általában 2-4 µg/ml koncentrációt alkalmaznak). Az enzimjelölést tartalmazó antitestekkel végzett inkubálást 30 percig szobahőmérsékleten végezzük, majd vízszintes lemezrázón rázzuk. A mosás PBST-vel 5-6 alkalommal történik.

V. Enzimreakció végrehajtása színes termék megjelenésével együtt

100 μl szubsztrát oldatot adunk a lyukakba, és 10 percig szobahőmérsékleten, állandó keverés mellett inkubáljuk.

VI. Az enzimreakció leállítása

Az optikai sűrűség mérése előtt a színreakciót 0,5 M H2SO4-gyel leállítjuk. Inkubálás után 50 μl 0,5 M kénsavoldatot adunk a lyukakba az OFD munkaoldattal. Ezt követően azonnal elkezdheti az optikai sűrűség mérését.

VII. Optikai sűrűségmérés

A színes termékoldat optikai sűrűségét λ=490 nm-en mérjük lemezes spektrofotométerrel.

nyomtatott változat

Immunoferiens analízis (ELISA)

Immunoferens elemzés vagy módszer (ELISA) - antigének kimutatása a megfelelő antitestek felhasználásával, amelyeket jelölő enzimmel (torma-peroxidáz, béta-galaktozidáz és/vagy alkalikus foszfatáz) konjugálnak. Miután az antigént az enzimmel jelölt immunszérummal kombináltuk, a szubsztrátot/kromogént adjuk a keverékhez. A szubsztrátot az enzim hasítja, és a reakciótermék színe megváltozik - a színintenzitás egyenesen arányos a megkötött antigén és antitest molekulák számával.

A komponensek kimutatása jelölt antitestek vagy antigének hozzáadásával történik. Pozitív eredménnyel a kromogén színe megváltozik.

Szilárd fázisú indirekt enzimes immunoassay

A következő komponens hozzáadása után minden alkalommal mosással távolítják el a meg nem kötött reagenseket a lyukakból.
I. Az antitestek meghatározásakor a páciens vérszérumát, az enzimmel jelölt antiglobulin szérumot és az enzim szubsztrátját/kromogénjét egymás után hozzáadjuk az adszorbeált antigént tartalmazó lemezek üregeihez.

II. Az antigén meghatározásakor az antigént (például a kívánt antigént tartalmazó vérszérumot) a szorbeált antitestekkel rendelkező üregekbe juttatják, hozzáadják az ellene lévő diagnosztikai szérumot és az enzimmel jelölt másodlagos (a diagnosztikai szérum elleni) antitesteket, és majd az enzim szubsztrátja / kromogénje.

Kompetitív ELISA az antitestek kimutatására: a kérdéses antitestek és az enzimmel jelölt antitestek versengenek egymással a szilárd fázison adszorbeált antigénekért.

A peroxidáz jelölés meghatározása fokozott kemilumineszcenciával. Hordozható eszközökkel végzett enzim immunoassay gyors módszereinek kidolgozása. Szinergia és a fokozás mértéke. A fénykibocsátás intenzitása és időtartama.

Enzim immunoassay fokozott kemilumineszcenciával

BEVEZETÉS

Az enzimjelölés kvantitatív módon meghatározható különféle módszerekkel, például kolorimetria, fluorimetria, radiometria és potenciometria alkalmazásával.

Az utóbbi időben erre a célra a kemilumineszcenciát vagy biolumineszcenciát is alkalmazzák. A fénykibocsátással járó reakciókkal meghatározható enzimjelöléseket a táblázat tartalmazza. 1. Általánosságban elmondható, hogy a kemi- és biolumineszcens detektálási módszerek érzékenysége nagyon magas, és ha enzim jelölésről történő jelerősítést is alkalmazunk, akkor a megfelelő immunoassay módszerek érzékenysége rendkívül magas legyen.

A biolumineszcens módszer lehetőségeit a közelmúltban a D-galaktozidáz meghatározásának példáján mutatták be. A galaktóz-dehidrogenáz AOH:PMN2 oxidoreduktáz-bakteriális luciferáz kapcsolt reakciójával 2 * 10″22 mol /3-galaktozidázt detektáltunk.

A torma-peroxidázt széles körben használják jelölőként az enzim-immunoassay-ben, és a konjugátumok előállításának és stabilizálásának módszereit jól tanulmányozták.

A torma-peroxidázt leggyakrabban kolorimetriásan határozzák meg, de különféle kemi- és biolumineszcens reakciók is alkalmazhatók erre a célra.

Részletesen tanulmányozták a peroxidáz meghatározását kemilumineszcens reakcióval a luminol-hidrogén-peroxid rendszerben, fenolos vegyületekkel fokozva.

Az enzimaktivitás meghatározásának ez a megközelítése számos előnnyel rendelkezik a többi meghatározási módszerhez képest; fő jellemzőit a táblázat tartalmazza. 2.

Erősítők. Különféle vegyületek, köztük a 6-hidroxi-benzotiazolok, például a luciferin, a fenolok, a naftolok és az aminok, képesek fokozni a fényemissziót a luminal peroxidáz által katalizált oxidációjában hidrogén-peroxiddal.

ábrán Az 1. ábra az egyes osztályok anyagainak képviselőinek szerkezetét mutatja. A fénykibocsátás erősítésének mértéke a reagensek koncentrációjától függ. A luminol és hidrogén-peroxid reakciójában a lumineszcencia intenzitása a peroxidáz által katalizált és a 6-hidroxi-benzotiazol által felerősített enhanszer koncentrációjától való tipikus függését mutatja a 3. ábra.

Szinergia és a fokozás mértéke. A rendszerben a peroxidáz - luminális - hidrogén-peroxid hatása a kék-

táblázatban megadott adatok tanúsága szerint rgizmus. 3. Az erősítés mértékét számos tényező befolyásolja; ennek ellenére a fénykibocsátás több mint 500-szoros növekedését sikerült elérni.

Bizonyos erősítők jelenlétében a luminol-hidrogén-peroxid rendszerben csökken a háttérfény emisszió. A peroxidáz aktivitásának meghatározásakor ez csak ilyen erősítők használatával teszi lehetővé a jel-zaj arány több nagyságrenddel történő növelését.

A lumineszcencia fokozása a különböző ciklikus diacilhidrazidokra jellemző, oxidálószerek hatására peroxindáz jelenlétében. Egyes peroxidáz aktivitású anyagok, például hemoglobin esetében nem figyelhető meg a fokozódás, amely csak kolorimetriás reakciókat katalizál.

Ez a tény a fokozott kemilumineszcens vizsgálat magasabb specifitását jelzi a kolorimetriás módszerekkel összehasonlítva. A kibocsátott fény spektruma gyakorlatilag azonos a fokozott és nem fokozott reakciókban. Ez „azt sugallja, hogy maga az erősítő nem bocsát ki fényt.

Fokozók hiányában a peroxidáz-luminol-peroxid rendszerben a kemilumineszcenciát korlátozni látszik az úgynevezett II-es vegyület formájában lévő peroxidáz viszonylag lassú reakciója a luminollal, ami luminol képződését eredményezi. gyökök és a peroxidáz regenerációja.

Az ilyen vegyülettel gyorsan reagálni képes fokozók növelhetik a fénykibocsátást azáltal, hogy felgyorsítják a (II) vegyület aktív peroxidázzá történő átalakulását.

A fokozó konverziós termékek ezután gyorsan reagálhatnak a luminollal, további luminol gyököket képezve, és ezáltal tovább fokozzák a fénykibocsátást. A fokozók az inaktív peroxidáz intermedierekre is hatnak, mint például a III.

Reagensek

A peroxidázaktivitás fokozott kemilumineszcenciával történő meghatározásában fontos tényező a ciklikus diacilhidrazidok kémiai tisztasága.

A luminol különböző mintáinak vizsgálata kimutatta, hogy a szennyeződések károsan befolyásolják a fénykibocsátást. A fotokémiai és termikus folyamatok hatására a luminol részben lebomlik, és a keletkező szennyeződések befolyásolják a fénykibocsátás kinetikáját és intenzitását.

táblázatban. A 4. ábra néhány kereskedelmi forgalomban kapható luminol készítmény, valamint a nátrium-hidroxid oldatból történő átkristályosítással tisztított luminol nátriumsó tisztaságának és tulajdonságainak összehasonlításának eredményeit mutatja be.

2. FEJLESZTETT KEMILUMINESZCENS IMMUNOASSESSZIÓ

Fokozott kemilumineszcens immunoassay-t peroxidáz enzimjelöléssel számos vegyület kimutatására alkalmaztak. A táblázatban számos példa található. 5. Ezekben az immunvizsgálatokban kompetitív és immunkomplex extrakciós módszereket, valamint leggyakrabban használt szilárd hordozókat használtunk.

a jel/háttér arány a torma-peroxidáz kemilumineszcens meghatározásában l-jódfenollal történő fokozással; 6 TLC - vékonyréteg-kromatográfia.

rizs. A 3. ábra a tüszőstimuláló hormon meghatározásának sémáját mutatja. Ennél a módszernél az FSH kimutatásának határa mikrotiterlemezen körülbelül 0,01 pmu. A módszert kiváló reprodukálhatóság jellemzi mind ugyanazon a futtatáson belül, mind a futtatások között.

A fokozott kemilumineszcencia módszerét sikeresen alkalmazták a peroxidáz jelölés kimutatására is a DNS hibridizáció vizsgálata során.

FLUORESCING ANTBODY MÓDSZER (MFA).

módszer a mennyiségi meghatározásra lemezes fotométerrel és kvalitatív elemzésre néhány pikogramos érzékenységű fényképes detektálással.

Eszközök

Jelenleg többféle luminométer kapható az iparban, amelyek alkalmasak fokozott kemilumineszcenciás reakciók során kibocsátott fény mérésére.

Néhány ilyen luminométert kifejezetten a fokozott kemilumineszcencia analízis érdekében módosítottak. A lumineszcenciát fokozó reakciókban a fénykibocsátás intenzitása és időtartama elősegítette olyan egyszerű luminométerek kifejlesztését, amelyek szilícium fotodiódákat vagy nagy sebességű fotófilmet használnak detektorként.

Az ilyen luminométerek viszonylag olcsók, hordozhatók, ezért laboratóriumokon kívül is használhatók. Jelenleg a MAST Immunosystems speciális kamerákat gyárt az allergén-specifikus immunglobulin E kemilumineszcens kimutatására ELISA módszerrel. Feltételezhető, hogy a jövőben ELISA és más vegyületek eredményeinek fényképes regisztrálását tartalmazó kitek készülnek, amelyek meghatározásához elengedhetetlen. klinikákon, kórházakban vagy otthon végezhető el.

Gyártott eszközök és reagenskészletek.

A továbbfejlesztett kemilumineszcens enzimes immunoassay készletek és a kapcsolódó műszerek már elérhetőek Amerlite néven az Amersham International pic.

A vizsgálatot mikrotiterlemezek csíkjain végezzük fehér szín, és a lumineszcencia mérést gyorsan és automatikusan végzi el egy erre a célra szolgáló mikrolemezes luminométer.

Jelenleg a pajzsmirigy-stimuláló hormon, a humán koriogonadotropin, a karcinoembrionális antigén, az alfa-fetoprotein, a tiroxin, a trijódtironin és a szabad tiroxin index meghatározására szolgáló készletek készülnek. Ezek a vizsgálatok nagy érzékenységgel és kiváló reprodukálhatósággal rendelkeznek.

KÖVETKEZTETÉSEK

A peroxidáz jelölés fokozott kemilumineszcenciával történő meghatározását nagy érzékenység, specifitás és egyszerűség jellemzi, és alapul szolgálhat kényelmes és gyors módszerek enzim immunoassay, amelyet olcsó hordozható eszközökkel végeznek.

Az enzim immunoassay elvei, az ELISA főbb típusai, alkalmazása a diagnosztikában

Immunvizsgálati módszerek az orvosi gyakorlatban, egy antigén és egy antitest kölcsönhatása annak alapjában.

Az immunoassay típusai a címke típusától és a vizsgálati körülményektől függően. Az enzim immunoassayben használt komponensek jellemzői.

absztrakt, hozzáadva: 2011.11.07

Szerológiai reakciók

Szerológiai reakciók, mint az antigének és antitestek közötti reakciók in vitro.

A szerológiai reakciók osztályozása az antigén természetétől és fizikai állapotától függően. Gélkicsapási reakció Ouchterlony szerint. Az enzim immunoassay módszere.

bemutató, hozzáadva: 2015.06.03

Az elektrokardiogram spektrális elemzése

Az elektrokardiogramok regisztrálásának és elemzésének eszközei. Analóg és digitális jelfeldolgozás összehasonlítása.

Szuperfelbontású elektrokardiográffal kapott elektrokardiojelek vizsgálata. Elemzési lehetőségek a MatLab csomag segítségével.

absztrakt, hozzáadva: 2011.12.09

A sugárzás alkalmazása az orvostudományban

Kezelés bronchiális asztma infravörös sugárzás. Az ultraibolya (UV) sugárzás mesterséges forrásai az orvostudományban. Ózon és ózonmentes baktériumölő lámpák.

Ivóvíz fertőtlenítése UV sugárzással. Röntgendiagnosztika, készülék készülék.

absztrakt, hozzáadva: 2009.08.27

Akromegália

Az akromegália a növekedési hormon (szomatotróp hormon) fokozott termelésével kapcsolatos betegség. A betegség klinikai képe. Az akromegália jellegzetes laboratóriumi mutatója a diagnózisban. Teszt tiroliberinnel. Röntgenkezelés.

bemutató, hozzáadva: 2012.05.03

Tumormarkerek a klinikai gyakorlatban

Laboratóriumi elemzés alkalmazása az onkológiai betegségek diagnosztizálására, valamint a műtét és a kemoterápia hatékonyságának posztoperatív monitorozására.

Tumormarkerek meghatározása enzim immunoassay, immunlumineszcens és radioimmunoassay módszerekkel.

absztrakt, hozzáadva: 2010.10.09

Fiziko-kémiai módszerek a gyógyszerek elemzéséhez

Fizikai és kémiai elemzési módszerek osztályozása. Molekulaabszorpciós spektrális elemzés. A sugárzás elnyelésének törvényei. vizuális kolorimetria. Koncentráció meghatározása fotoelektrokolorimetriában. Gyógyszerek spektrofotometriája.

absztrakt, hozzáadva: 2010.11.14

Az aktivált kemilumineszcencia fő alkalmazásai

A reakciók mechanizmusa, amelyet az élő szervezetek szabad szemmel is látható fénye kísér.

Az aktivált kemilumineszcencia és biolumineszcencia alkalmazása a vérszérum, a vizelet, az agy-gerincvelői folyadék és a nyál orvosi és biológiai vizsgálataiban.

szakdolgozat, hozzáadva 2011.10.25

A fertőző betegségek diagnosztizálásának modern módszerei

Az állatok fertőző betegségeinek diagnosztizálására szolgáló módszerek.

Polimeráz láncreakció. Enzim immunoassay, céljai. Staphylococcusok, pneumococcusok és szalmonellafertőzések által okozott fertőzések diagnosztizálása. A brucellózis kórokozója, diagnózisa.

absztrakt, hozzáadva: 2013.12.26

Lumineszcens címkék

A lumineszcencia fogalma, fizikai természete és előfordulási okai.

Stokes-szabály. A lumineszcencia típusai (fotolumineszcencia, kemilumineszcencia) és kibocsátása. A hősugárzás alaptörvényei. Anyagok lumineszcens, kvalitatív és kvantitatív elemzése.

bemutató, hozzáadva 2016.05.05

A koszorúér-betegség

1.1 A koszorúér-betegség osztályozása

Az IHD számos olyan betegséget foglal magában, amelyek klinikai megnyilvánulásai jelentősen különböznek egymástól.

Krónikus pulpitis klinikája: rostos, hipertrófiás, gangrénás

Osztályozás

Akut pulpitis pulp hyperemia savós korlátozott savós diffúz gennyes traumás Krónikus pulpitis rostos gangrén hipertrófiás (proliferatív) Krónikus pulpitis súlyosbodása Krónikus ...

laktációs tőgygyulladás

4.

Osztályozás

A tőgygyulladás műtéti osztályozása: I. A betegség miatt: 1. Nem specifikus. 2. Specifikus. II. Az emlő funkcionális állapota szerint: 1. Szoptatás.

Enzim immunoassay (ELISA)

2. Nem laktáció. III. A gyulladásos folyamat során: 1. Akut. 2. Krónikus. IV...

Az urolithiasis gyógyászatában használt gyógynövények és gyógynövény-anyagok

1.1 Osztályozás

Az urolithiasis a kövek lokalizációja szerint osztályozható: vesekövek és húgycsőkövek (nephroureterolithiasis), kövek Hólyag. Talán az urolithiasis felosztása a kalkulus összetételének megfelelően ...

A gége rákja

3.

Osztályozás

A gégerák hazai besorolása szerint (Egészségügyi Minisztérium Útmutatógyűjteménye, 4 stádiumot különböztetnek meg: I. szakasz: a daganat a gége egy szakaszának csak egy részét foglalja el, nem hatol mélyebbre, mint a nyálkahártya alatti réteg ...

húgyhólyagrák

2. Osztályozás

A húgyhólyag-daganatokat többnyire átmeneti sejtes karcinóma képviseli.

A diagnosztikai hibák megelőzése érdekében azonban nem szabad elfelejtenünk, hogy ...

Nyelőcső karcinóma

Osztályozás

A nyelőcső daganatainak nemzetközi szövettani osztályozása (1990): Hámrákok. jóindulatú daganatok. Laphám papilloma. Vírusos szemölcs. Adenoma. Rosszindulatú daganatok.

Laphámrák…

Sebek, sebek osztályozása, mechanikai antiszeptikumok a sebek kezelésében

Sebek besorolása

A sebeknek többféle osztályozása létezik. A szövetkárosodás jellege szerint a sebeket megkülönböztetik: szúrt, vágott, vágott, zúzódásos, szakadt, harapott, mérgezett, lőtt. A szúrt sebeket szúrófegyverrel (szurony, tű stb.) ejtik...

A tannin növényi forrásai és felhasználásuk a gyógyászatban

2.

Osztályozás

Minden tannin van osztva tanninok csoportok: hidrolizálható és kondenzált. A hidrolizálható tanninok híg ásványi savak, bázisok és taninacil-hidroláz enzimek hatására szénhidrátokká és fenolkarbonsavakra bomlanak...

Agybénulásos gyermekek rehabilitációja

1.2 Az agyi bénulás osztályozása.

Jelenleg az Orosz Föderáció a K.A. osztályozását használja.

Semenova (1974). - spasticus diplegia - túlnyomóan a láb elváltozása - kettős hemiplegia - spasticus tetraparesis, a kezek valamivel jobban érintettek...

Rheumatoid arthritis

1. Osztályozás

A rheumatoid arthritis évtizedek óta a reumatológiai tudomány figyelmének középpontjában áll, ami jól tükrözi a betegség általános orvosi és társadalmi jelentőségét...

A nem gyógyszeres kezelési módszerek szerepe a bronchiális asztma kezelésében

1.1.1 Osztályozás

A bronchiális asztma (BA) exacerbációs fázisra (a betegség magassága) és remisszióra (amikor gyakorlatilag nincsenek a betegség jelei) oszlik.

Asztmás rohamban a prekurzorok időszakát különböztetjük meg (tüsszögés, orrfolyás stb.).

A mentős szerepe a tetanusz diagnosztizálásában, kezelésében és megelőzésében. Járványellenes intézkedések a fertőző betegségek fókuszában. A tetanuszbetegségek dinamikája és összehasonlító elemzése a Salsky kerületben a 2013-2014 közötti időszakra.

1.4 Osztályozás

Az osztályozási jellemzők különféle tényezőket - a fertőzés mechanizmusát, a görcsös szindróma prevalenciáját és súlyosságát, valamint a klinikai lefolyás jellemzőit - figyelembe veszik.

Ezeket a tényezőket figyelembe véve a tetanusz következő formáit különböztetjük meg: 1 ...

A mentős szerepe a diagnosztikai, terápiás és megelőző intézkedések a magas vérnyomás leküzdésére

1.2 Osztályozás

A betegség tanulmányozásának teljes időtartama alatt a magas vérnyomás egynél több osztályozását fejlesztették ki: a szerint kinézet a beteg, a nyomásemelkedés okai, etiológiája, a nyomás mértéke és stabilitása, a szervkárosodás mértéke, a lefolyás jellege ...

Cukorbetegség

1.1 Osztályozás

Az osztályozásnak többféle típusa van cukorbetegség, amelyek alapján klinikai kép, etiológia, a szénhidrát anyagcsere kompenzáció mértéke, a kezelés súlyossága, szövődmények…

Enzim immunoassay (ELISA)- korszerű laboratóriumi vizsgálat, melynek során specifikus antitesteket keresnek a vérben vagy adott betegségek antigénjeit annak érdekében, hogy ne csak az etiológiát, hanem a betegség stádiumát is azonosítsák.

Az ELISA eredmények minőségileg és mennyiségileg is kiadhatók.

Jelenleg az ELISA-t a következő helyzetekben használják:

1) specifikus antitestek keresése bármely fertőző betegség ellen;
2) bármely betegség (fertőző, nemi betegségek) antigénjeinek felkutatása;
3) a beteg hormonális állapotának vizsgálata;
4) tumormarkerek vizsgálata;
5) autoimmun betegségek jelenlétének vizsgálata.

Az ELISA módszer előnyei:

1) Az ELISA módszer magas specificitása és érzékenysége (több mint 90%).
2) A betegség meghatározásának és a folyamat dinamikájának nyomon követésének képessége, vagyis az antitestek mennyiségének összehasonlítása különböző időintervallumokban.
3) ELISA diagnosztika elérhetősége bármely egészségügyi intézményben.

Relatív hátrány:

1) Az immunválasz (antitestek) azonosítása, de magát a kórokozót nem.

Alapfogalmak

Mielőtt tisztáznánk az ELISA módszer lényegét, ismerjünk meg röviden néhány fogalmat.
Antitestek (vagy immunglobulinok - Ig)- B által termelt specifikus fehérjék
limfociták (immunsejtek) válaszul bármely fertőző kórokozó (vírusok, baktériumok, gombák stb.) lenyelésére.

Vannak immunglobulinok A (IgA), immunglobulinok E (IgE), immunglobulinok M (IgM), immunglobulinok G (IgG), immunglobulinok D (IgD). Eltérnek egymástól molekula alakjukban és tömegükben, felezési idejükben, a fertőző folyamatokban való részvételben / nem részvételben, a fertőzés pillanatától számított kimutatási időben. Ha figyelembe vesszük a molekulatömeget, akkor leginkább az IgM rendelkezik vele - ez egy pentamer (950 000 dalton), ellentétben az Ig többi részével (150 és 200 000 Da között), ami miatt az IgM egyszerűen nem tud átjutni a placenta gáton.

Ezért az IgM kimutatása egy 1 éves gyermeknél mindig a magzat fertőzésének jele. A vérszérumban az immunglobulinok nagy részét az IgG (75-85%) képviseli, a legalacsonyabb az IgE (0,003%). A fertőzési folyamatban csak az IgA, M, G vesz részt közvetlenül.Az IgE allergiás reakciók és betegségek jele, az IgD pedig csak a nyirokcsomók és a mandulák szövetében található, a helyi immunitás kialakításában játszik szerepet.

Immunglobulin osztályok

Antigének- szerves eredetű makromolekuláris anyagok, különösen fertőző és egyéb betegségek kórokozói, valamint egy adott betegségben (autoimmun betegségek, onkológia) képződő különféle megváltozott sejtek anyagai.

immunkomplex- az immunfolyamatban részt vevő antigén-antitest komplex.

Mi az ELISA módszer alapja.

Az ELISA-nak többféle típusa (direkt, indirekt, blokkoló módszer, kompetitív) létezik, azonban a gyakorlatban leggyakrabban a heterogén szilárd fázisú immunoassay vagy ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) használatos.

Az enzimkapcsolt immunszorbens assay alapja egy antigén és egy antitest immunreakciója immunkomplex: antigén-antitest képződésével, melynek eredményeként megváltozik az antitestek felületén lévő specifikus jelölők enzimaktivitása.

Az ELISA módszer lényege

Egyszerűen fogalmazva, ez a folyamat több szakaszra osztható:

1) A vizsgálatot végző orvos tablettájának üregeinek felületén egy bizonyos kórokozó tisztított antigénje található.

Amikor a páciens biológiai anyagát (vérszérumot) adják hozzá, specifikus reakció lép fel ezen antigén és a kívánt antitest (immunglobulin) között. Ez a vegyület a következő lépésben "speciális antigénként" fog működni.

2) Ebben a szakaszban az IR (immunkomplexek) képződése zajlik - a „speciális antigén” és a konjugátum (ez egy peroxidáz enzimmel jelölt immunglobulin) közötti reakció. Speciális kromogént adnak hozzá. Egy ilyen enzimatikus reakció eredménye egy színes anyag képződése a tabletta üregében, amelynek színintenzitása a páciens anyagában lévő immunglobulinok (antitestek) mennyiségétől függ.

3) Ezt követően az eredmény értékelése: fotometria többcsatornás spektrofotométerrel, a vizsgált anyag optikai sűrűségének összehasonlítása a kontrollminták optikai sűrűségével, az eredmények matematikai feldolgozása.

A páciensben lévő antitestek mennyisége közvetlenül függ az adott lyuk optikai sűrűségének magasságától.

A gyakorlatban jellemzően 96 lyukú lemezeket használnak.

A tesztfolyadék optikai sűrűségének (OD) mérésekor kiszámítjuk az antitestek mennyiségét (vagy koncentrációját) egy adott térfogategységben.

Az eredményt ezután összehasonlítják egy kontrollmintával.

Emlékezned kell: minden tesztrendszerhez egyedi mutatókat dolgoznak ki, hogy figyelembe vegyék az eredményeket, a norma és a patológia mutatóit (vagyis „referenciaértékeket”). Ezt figyelembe kell venni az egyes konkrét vizsgálatok eredményeinek értékelésekor. Nem helyes egy laboratórium eredményeit egy másik laboratórium "referenciaértékeiből" értelmezni.

Ugyancsak helytelen a különböző laboratóriumok eredményeinek összehasonlítása egymással.

Az ELISA-reakciók felállításakor fontos az olyan fogalom, mint az antitest-aviditás.
Antitest aviditás- ez az antitest-antigén kötés erőssége és az immunglobulinokkal (antitestekkel) kapcsolatban álló antigén mennyisége.

Az aviditásnak nagy jelentősége van a fertőzés várható időtartamának megítélésében, ami rendkívül fontos a terhes nők elsődleges fertőzésének diagnosztizálásában.

Az antitest aviditási teszt alapja az immunkomplex (antigén-antitest) karbamid oldattal történő kezelése a fehérje elpusztítása érdekében.

Az erősen lelkes kötések érintetlenek maradnak, míg az alacsony lelkességű kötések megsemmisülnek. Az eredményt aviditási indexként adjuk meg, százalékban (%) kifejezve.

Milyen betegségeket mutat ki az ELISA diagnosztika?

Az autoimmun betegségek markerei és a humán immunitás indikátorai (összes IgE, összes IgG, össz IgA, össz IgM, össz IgD, szekréciós IgA, IgG 2, IgG4, CEC-ben keringő immunkomplexek, IgA és IgG gliadinra és mások)

3. Onkológiai markerek (TNF - tumor nekrózis faktor, CEA - rák-embrionális antigén, PSA - prosztata-specifikus antigén, hCG - humán koriongonadotropin, CA 125, alveomucin és még sokan mások)

Reproduktív rendellenességek (ösztradiol, progeszteron, prolaktin, tesztoszteron, AFP-alfafetoprotein, FSH - follikulus-stimuláló hormon és mások)

5. A pajzsmirigy betegségei (szabad és kötött T3, T4, tiroglobulin, tiroperoxidáz - TPO, pajzsmirigy-stimuláló hormon - TSH).

Ezt a listát nem minden olyan betegség képviseli, amelyet enzim immunoassay segítségével diagnosztizáltak.

Anyag az ELISA elemzéshez és a gyűjtés szabályai

Az ELISA reakció leggyakoribb anyaga a beteg vérszéruma, amelyet éhgyomorra vesznek.

Az anyag cerebrospinális folyadékként, magzatvízként, az üvegtest tartalma, a nyaki csatorna és a húgycső nyálkaként, kenetként is szolgálhat.

A betegek felkészítése az ELISA-hoz szükséges anyag szállítására

A vért éhgyomorra veszik. Véradás előtt nem kell gyógyszert szednie.

Az anyag immunenzimatikus elemzése gyorsan, egy napon belül megtörténik.

Különböző laboratóriumokban késések lehetnek bizonyos mennyiségű szérum felhalmozódása miatt.

Az ELISA diagnosztika lehetséges eredményei

A specifikus fertőzések eredményeinek értékelésekor fontos a kimutatott antitestek osztálya és számuk.

Ez nemcsak a fertőzés etiológiájának kérdését határozza meg (akár az, akár nem), hanem a betegség várható stádiumát (akut, krónikus), valamint egy aktív fertőzés jelenlétét (akut vagy krónikus súlyosbodás). a vizsgálat időpontjában.

Mi az antitestek (immunglobulinok - Ig) megjelenésének hozzávetőleges ideje?

A legkorábbi antitestek az IgM.

Enzim immunoassay (ELISA)

Egy esetleges fertőzés után 1-3 héttel észlelhetők, ami a fertőzéses folyamat akut fázisát jellemzi. Az IgM antitestek megjelenésének második helyzete egy krónikus folyamat aktiválása (vagy súlyosbodása). Az IgM antitestek átlagosan körülbelül 3 hónapig keringenek, majd fokozatosan eltűnik a számuk. Egyes betegeknél azonban a fertőzést követő 1-2 éven belül nyomokban IgM kimutatható.

A modern tesztrendszerek rendkívül érzékenyek, és nem specifikus hamis pozitív eredményeket adnak (gyakran terhes nőknél).

Ezért ebben a betegcsoportban a pozitív IgM-et újra ellenőrizni kell!

Az IgA antitestek a fertőzés után 2-4 héttel jelennek meg, de a kimutatáshoz elegendő mennyiségben - egy hónap múlva. A szérum IgA-t a lép, a nyirokcsomók és a nyálkahártyák plazmasejtei szintetizálják, a szekréciós IgA a nyálkahártyákon koncentrálódik, hogy elláthassa védő funkcióját - részt vesznek a helyi immunitásban.

A fertőzést követő 4. héttől kezdenek megjelenni az IgG antitestek.

A legtöbb fertőzésben a titerük fokozatosan emelkedik maximummal különböző dátumok(átlagosan 1,5-2 hónap), ekkor a titer alacsony szinten marad és immunitást jelez. Egyes betegségekben (mikoplazmózis, chlamydia, trichomoniasis) az IgG szintje nem magas, ezeknél a fertőzéseknél az immunitás hiánya miatt jelentősen csökken.

Lehetőségek különböző osztályú antitestek kimutatására:

— Az IgM antitestek izolált kimutatása elsődleges
fertőzések.
- Az IgM és IgG egyidejű kimutatása a vérben az elsődleges fertőzésre jellemző
az előző 2-3 hónapban, valamint egy krónikus betegség súlyosbodása során.

Ezért terhesség alatt az IgM jelenléte nem mindig az elsődleges fertőzés jele.
- Az IgG izolált kimutatása jelezheti mindkét immunitást ezzel a betegséggel szemben,
valamint krónikus fertőzés. A második helyzetben mind az antitestek mennyisége (titer), mind ennek a titernek az időbeli változása számít. A vizsgálatokat általában 2-4-6 hetes időközönként végzik.
— Az IgA önmagában vagy IgM-mel történő kimutatása elsődleges fertőzést jelez. Nál nél
az IgA és az IgG együttes megjelenése várhatóan krónikus fertőzést aktivál (átlagosan 2 hét az exacerbáció pillanatától számítva).

Az IgG antitestek aviditásának meghatározása kiváló kiegészítő lépés a régóta fennálló fertőzésből származó primer fertőzés diagnosztizálásában, melynek klinikai jelentősége van, elsősorban a magzat méhen belüli fertőzésének kockázatának felmérésében.

Az alacsony lelkesedésű IgG kimutatása primer fertőzésre utal, és átlagosan a fertőzés után 4-6 hónappal, ritkán hosszabb ideig észlelhető. Az alacsony IgG-k esetében az elsődleges fertőzés (IgM) egyéb laboratóriumi megerősítése szükséges.

Az erősen lelkes antitestek vagy egy krónikus betegség és annak súlyosbodásának, vagy a kialakult immunitás jelei.

Jellemzők csecsemőknél: gyermekeknél egy éves, néha 1,5 éves korig az anyai IgG a vérben kering különböző fertőzésekhez (vagyis a magzati fejlődés során átjut a méhlepényen az anyától a magzatig).

Önmagukban nem jelzik a fertőzés jelenlétét a jelenben. Ha ebben a korban IgM-et észlelnek (emlékezzünk arra, hogy az anyai IgM nem tud átjutni a placentán), akkor ez méhen belüli fertőzésre vagy születés után szerzett fertőzésre utal.

Kvantitatív ELISA módszer

Az ELISA diagnosztika eredményét (enzim immunoassay analizátorral) bizonyos mértékegységekben adják ki:
— A minta optikai sűrűsége (OD) a specifikus antitestek térfogategységenkénti koncentrációja.

Minél nagyobb a minta OD-ja, annál magasabb az antitestkoncentráció. Az eredmények egy része a pozitivitási együtthatóról (PC) beszél – ez egyben a minta optikai sűrűsége is.
— Az antitestkoncentráció egységei (nanogram/milliliter vagy ng/ml).

- Szérumtiterek formájában: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 és így tovább. A diagnosztikai titerek (amelyeknél a betegséget diagnosztizálják, és nem a fertőzés tényét) különböző betegségek esetén eltérőek.
- Szimbólumok formájában - "+", "-", "?" (+, ++, +++, ++++).
- Minőségi értékelés formájában adott szempont szerint (pozitívan vagy negatívan).

Helyesen értékelje az antitestek mennyiségét, az immunglobulinok osztályának egyik változatát, és ezért csak orvos tudja meghatározni a betegség stádiumát és a kezelés szükségességét.

Nem szabad megfeledkeznünk arról, hogy minden tesztrendszerhez kidolgozzák a saját „referenciaértékeit” (a norma változatait), amelyek túllépése esetén egy adott betegséget (patológiai változatokat) diagnosztizálnak.

A különböző tesztrendszereknél a „referenciaértékek” eltérőek.

Az ELISA dinamikai eredményeinek helyes összehasonlítása csak akkor lehetséges, ha azokat ugyanabban a laboratóriumban készítik.

Fertőző betegségek specialistája, Bykova N.I.